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探討顯微鏡攝像頭成像質量影響因素

時間: 2020-12-10 09:37 編輯: 北京瑞科中儀閱讀:

由于顯微成像技術的進步,市面上可供使用的顯微鏡專用攝像頭有很多,而我們進行選擇的時候,需要根據自身的實際情況進行選擇,但最重要的一點就是我們都渴望可以得到成像質量高的顯微鏡攝像頭。那么確保顯微鏡攝像頭成像質量的最重要因素還是要根據自身的適用性進行分析,為了確保成功的顯微成像,選擇適當的光學顯微鏡和攝像頭是必要的。例如,科學互補金屬氧化物半導體(Scmos)攝像頭是一個很好的選擇,大多數熒光成像,但不適合長期曝光的應用,如生物發光成像。下面我們就根據應用詳細說明了顯微鏡攝像頭的性能和優勢需要考慮的主要因素。
圖像成像質量的關鍵要素有哪些?
“分辨力:顯微鏡可以用來觀察光學上難以分辨的微小結構。這些光學限制意味著較高的像素數或較小的像素間距并不總是提供更高的分辨率。要獲得更好的分辨率,關鍵是選擇合適的像素間距與數值孔徑(NA)、光學系統的總放大率和樣品的空間頻率有關。圖1是調制傳遞函數(MTF)的原理圖,顯示了具有500 nm光和5m像素間距的成像系統的響應。圖1(A)表示傳感器的奈奎斯特頻率(即傳感器采樣頻率的一半或傳感器像素間距的倒數)低于Eq.1中定義的光學截止頻率。在這種情況下,值得嘗試更小的像素間距來獲得更高的分辨率。另一方面,在圖1(B)和(C)的情況下,較小的像素傳感器不能提供更高的分辨率,因為來自樣品的光以光學系統的點擴展函數(PSF)方式傳播遠大于像素間距。還應仔細考慮樣本的空間頻率。工業樣品往往具有銳利的邊緣,這意味著它們比生物樣本具有更高的空間頻率,并且需要更高的采樣間距。
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圖1-MTF圖(左)和圖,其中一個像素陣列的成像儀被投影到一個樣本(右)來解釋PSF和像素間距之間的關系。(A)10×NA 0.4,(B)10×NA 0.2,(C)40×NA 0.9
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靈敏度和噪聲:高信噪比是可靠數據的關鍵.在某些情況下,使用非常明亮的樣本,這是很容易實現的。但在實際應用中,信噪比具有物理和技術上的局限性。物理限制是由于傳感器芯片中產生的光電子數的統計誤差,這是由樣品的亮度和攝像頭的靈敏度決定的。攝像頭的靈敏度取決于它的量子效率(QE)和像素面積。與人們普遍的看法相反,量化寬松并不是提高敏感性的唯一影響因素。像素基音可以提供更大程度的改善,即使稍微增加。例如,如果將傳感器的像素間距從5.5m改為6.5m,靈敏度提高了40%左右,而在75%和90%的QE之間,靈敏度只提高了20%。QE應在您的觀察波長仔細確認。彩色攝像頭的QE可高達60%,但值得注意的是,由于拜耳彩色濾光片通常應用于彩色攝像頭的傳感器,因此只有四分之一到一半的像素能夠檢測到每個波長的熒光光。
技術上的局限性主要是由暗電流和讀出噪聲引起的,包括電路上的電噪聲。今天,傳感器冷卻被用來抑制CMOS和sCMOS傳感器上的熱像素,盡管在過去,這被傳統上用作長曝光時間的暗電流抑制形式。然而,對于大多數攝像頭來說,在不到2秒的曝光時間內,暗電流不再是一個問題。這些限制用Eq.2和3表示,這表明攝像頭的靈敏度和讀出噪聲是在較短曝光時間內獲得更好信噪比的關鍵因素。例如,如果使用帶有3e-RMS讀出噪聲和0.05 e/s/像素暗電流的照攝像頭,則暗電流對背景噪聲的貢獻比曝光時間小于2秒的讀出噪聲的貢獻小約2個小數點。
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幀速率快速幀速率是實時圖像觀看過程中平滑操作的首要要求。由于諸如USB3.0和CMOS技術等高速接口,最近許多攝像頭的幀率都超過每秒30幀(Fps),具有實際的分辨率。然而,有許多應用需要更高的幀速率;例如:(1)病理咨詢和病例會議,這要求快速顯微鏡操作后順利進行實時成像;(2)快速生物現象的高質量成像;(3)體積觀測,如光片熒光顯微鏡(LSFM);(4)計算成像,包括基于圖像處理的超分辨率成像。在昏暗熒光顯微鏡的情況下,與曝光時間有關的實際限制。為了解決這一問題,采用了二值化或其他圖像處理技術來提高信噪比。卷簾引起的圖像失真是CMOS傳感器快速讀出特性的一個副作用。對于快速移動的樣本,全局快門和全局重置功能是一個理想的解決方案,可以幫助抑制失真。
動態范圍在單色攝像頭方面,不應將動態范圍比作模擬-數字(AD)轉換位深度,而是圖像數據的全比特深度與以位為單位的讀出噪聲的比率。隨著適當的高端16位攝像頭,動態范圍的問題,在一般熒光成像是罕見的.彩色攝像頭的情況是不同的。這是因為彩色圖像數據每個RGB通道都有8位限制,每個RGB通道都有標準監視器。8位是不夠的,因為人的眼睛有更大的動態范圍,因為能力,不斷適應亮度。要獲得良好的圖像質量,關鍵在于設計一條符合人眼反應的對比度曲線(圖2)。
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圖2-一個圖像的例子,有一個精心設計的對比度曲線(左)顯示蒼白明亮的細胞和黑暗的分層細胞。設計差的對比度曲線(右)的圖像不是。
視野(FOV):有些帶有大圖像傳感器的攝像頭可以在18毫米對角線范圍內提供視場,甚至有1x攝像頭適配器。其他攝像頭,那些相對較小的傳感器,通過使用小于1倍放大率的攝像頭適配器實現寬視場。然而,這樣做引起了對陰影和光學像差的關注,特別是當你遠離光軸(對角線超過18毫米)時(圖3)和你執行圖像拼接時(圖4)。
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圖3-FOV尺寸的光強平整度示意圖。一般來說,由低放大率適配器或更大的傳感器提供的較大的FOV比較小的FOV配置(A)產生更差的平整度(B)。平面度在很大程度上取決于物鏡和光學結構。
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圖4-陰影(光強的不均勻性)突出與圖像拼接(右);它是不太明顯的個別視場圖像(左)。
色彩再現:因為人類眼睛的光譜反應與攝像機感應器不同,所以攝像頭銷售商需要使用多種技術在顯示器上獲得與你通過顯微鏡觀察到的顏色相似的顏色。適當的白平衡(WB)是實現適當顏色復制的第一步。一個自動化的WB功能專門用于Brightfield(BF)觀測,它可以幫助您擺脫耗時的手工操作,因為它會自動檢測實時BF圖像中的“白色”背景。為了達到高的顏色保真度,圖像處理通常涉及顏色矩陣,它將RGB信號從傳感器轉換為監視器上的R‘GB’信號。但這一過程受到獨立軸數的限制,例如,由于這兩種顏色都含有紅色信號,因此不能獨立地調整伊紅,而不依賴于民建聯染色的棕色。多軸顏色調整是一種方法,以繞過這一限制,并優化顏色的各種污漬(圖5)。顏色空間和與顯示器的顏色匹配也很重要。AdobeRGB顏色空間可以表示更大范圍的顏色,這特別有利于生動的綠色,如Masson的三色染色,但如果沒有適當的ICC配置文件交換,則AdobeRGB監視器的圖像數據無法顯示在其他sRGB監視器上。
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圖5-通過傳統的顏色調整,eosin的紅色增強會影響所有其他染色,而多軸顏色調整(右)則可以獨立地優化每個染色的顏色。
本節討論的所有關鍵要素都不是獨立的。分辨率,靈敏度,幀速率,特別是視場,是密切相關的。當觀察一個樣本的區域時,較小的像素間距提供了較高的分辨率,但靈敏度較低,而具有較低放大率的攝像頭適配器則提供了較低的分辨率、更高的靈敏度和更寬的視場。為了避免在準備過程中對樣品造成光毒性損傷,使用雙寧可以縮短曝光時間,提高幀速率。誠然,當您使用二進制技術時,會犧牲一些分辨率,但是在實驗建立階段,分辨率就不那么重要了。
圖像處理與功能成像
在某些應用中,圖像處理被用來超越傳統的光學和物理的局限性。擴展聚焦圖像(EFI)技術可用于在一幅圖像中獲取厚樣本(圖6),特別是使用立體顯微鏡。高動態范圍(HDR)成像通常用于工業檢測,因為它能夠捕獲反射樣品(圖7)。提高熒光實時圖像信噪比的技術有很多種。例如,自動多幀平均(只在顯微鏡臺面靜止時起作用)是實現快速幀速率和高信噪比的一種方法,同時最大限度地減少了對樣品的光毒性損傷。
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圖6-EFI:(左)沒有EFI,(右)有EFI
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圖7-HDR:(左)沒有HDR,(右)帶有HDR
關于圖像質量的討論是復雜的,因為關鍵因素是相互關聯的;然而,在選擇顯微鏡攝像頭時,最好根據顯微鏡觀察的最重要要求作出決定。市場上有各種各樣的攝像頭選擇,使您能夠構建一個平衡每個元素的系統。在購買之前進行徹底的評估是確定應用程序合適的攝像機的可靠方法,因為攝像頭之間的復雜性和性能差異并沒有在它們的規范表中描述。選擇合適的光學和攝像頭為您的應用提供更多的數據和更高的圖像質量,先進的圖像處理使您能夠超越傳統的限制顯微成像。”
 
 
引自:
小野正子(Takeo Ogama)
科學解決方案司
奧林匹斯美洲公司
 

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